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Sperm DNA damage assessment SCSA: "A test whose time has come"

Untersuchungen zum Zustand der spermatologischen Kernstrukturen erweitern die moderne andrologische Diagnostik in wesentlichen Punkten

 

Dr. med. Christian Sigg
Leitender Arzt des Instituts für Dermatohistopathologie und Andrologie
Regensbergstrasse 91
8050 Zürich

Tel. 044/312 47 57
Fax 044/311 21 27

© 2006

 

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Einleitung

Während der Spermiogenese und Spermiohistogenese finden komplexe Veränderungen der Chromatinstrukturen statt, die unterschiedliche Generationen von Nukleoproteinen und spezifische lamelläre Anordnungen betreffen. Die nukleären Proteine der Spermien sind zunächst sehr einfach und enthalten grosse Mengen von Arginin.   Zystein - überbleibsel sind ebenfalls zahlreich vorhanden und werden während der Spermienreifung im Hoden und teilweise auch im Nebenhoden ausgetauscht. So zeigen beispielsweise bei der Ratte 100% der Zysteine im Hoden freie SH Gruppen, im Nebenhoden schliesslich aber alle Disulfidformen. Dieser Wandel der Bindungen und Austausch von Nukleoproteinen äussert sich in zahlreichen, der jeweiligen Entwicklungs-stufe entsprechenden charakteristischen histochemischen Färbungen und zunehmender Restistenz der DNA gegenüber thermischen und chemischen Denaturationen und Dekondensationen.

Beim Menschen werden zur Kernkondensation 85% der Histone durch Protamine ersetzt. Die verbleibenden 15% sogenannter Nukleohistonkomplexe initiieren später die Dekondensation. Dieser entscheidende Vorgang nimmt speziesspezifisch unterschiedliche Zeit in Anspruch und dauert beim Menschen nach Mikroinjektion  30-60 Minuten. Schliesslich sind 95% der Nukleone dekondensiert und nun in der Lage, Sauerstoff  aufzunehmen und damit auch den ATP Level erheblich anzuheben. Diese Aktivitäten spielen sich bemerkenswerter Weise ohne das Zutun der Akrosomen- oder anderer Membrane,  Zellorganellen oder Proteine ab.

Die zunehmende Zahl von Disulfidbindungen innerhalb der Kernprotamine führt zu einer verbesserten Stabilität der Spermienköpfe. Sie zeigen später im reifen Zustand unterschiedliche Resistenz gegenüber  Detergenzien, so vor allem Natrium Dodecylsulfate oder NDS in Verbindung mit Disulfid-Bindungsreduzierenden Agentien wie Dithiothreitol DTT. Unreife Spermien dekondensieren schneller und vollständiger als reife Spermien.

 

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Moderne SCSA Tests

Mit dem SDS Test werden nun fluoreszenzoptisch die Dekondensationsstadien eines Ejakulats erfasst und quantifiziert. Auf diese Weise gelingt es, wichtige und für die klassische Therapie verwertbare Hinweise zu erhalten. Zudem erlaubt die Bestimmung der Anzahl im SDS Test normaler Spermien prognostische Aussagen über die Verwertbarkeit eines Ejakulats für die IVF.

Acridin Orange (AO) wird zur Unterscheidung von Spermien mit normalen oder abnormen Chromatinstrukturen verwendet. In zahlreichen Studien wurde diese Substanz bereits zur in situ Untersuchung der Nukleinsäuren eingesetzt. AO bindet an Nukleinsäuren und andere Makromoleküle. Bei geringen Konzentrationen ergibt die monomere AO Form ein grünes Fluoreszenzsignal aber bei höheren Konzentrationen ergeben sich durch Aggregationen und Polymersiationen Farbstoffinteraktionen und Verschiebungen der Fluoreszenzfarbe nach gelb bis rot. Ein AO Molekül interferriert grün mit jedem dritten Basenpaar einer DNA Doppelhelix, rot dagegen mit denaturierter oder einsträngiger DNA. Normale Spermien - Chromatinstrukturen ergeben damit ein grünes, denaturierte oder einsträngige Formen ein gelbes oder rotes Signal.

Zusammen mit dem bereits seit langem in die andrologische Routinediagnostik eingeführten Anilin-Blau Test ist es damit möglich, sowohl den Kondensationsstatus (ABB), den Dekondensationsstatus (SDS) als auch die Chromatinstrukturen fluoreszenzoptisch zu erfassen. Alle  diese Untersuchungensmethoden erlauben Aussagen über Vorgänge innerhalb der Chromatinstrukturen, die mit den klassischen Routinemethoden nicht erfasst werden können und die als unabhängige Vorgänge der Fertilisation enorm wichtige Zusatzinformationen liefern.

Die spermatologische DNA Fragmentation stellt nun den aussagekräftigsten Maker der Apoptose dar und wird durch abnorme Endonukleaseaktivität durch Protein Fas vermittelt. Erhöhte Werte (über 10%) fanden sich bei Paaren mit habituellen Aborten, bei sog unexplained infertility als auch bei Teratozoospermien. Weitere Zusammenhänge wurden mit gestörter Motilität der Spermien, mit verminderter Fertilisierungsrate bei IVF und normaler Embryoentwicklung beobachtet. In zahlreichen Arbeiten zeichnen sich Werte von 30% Spermien mit geschädigter Chromatinstruktur als Grenzwert ab, die eine verminderte Zeugungsfähigkeit oder geringere Chancen bei IVF Therapien bedeuten.

Die TUNEL Methode erlaubt die Erfassung der DNA Fragmentation durch die terminale Desoxynukleotidyl-transferase-vermittelte Desoxyuridin-triphosphat-biotin Färbung. Die DNA Fragmentation lässt – unabhängig von der Spermatozoenmorphologie oder Spermiendichte – Aussagen über die Ejakulatqualität zu, insbesondere bei sog. Unexplained infertility, bei Abortgeschehen als auch vor einer IVF Behandlung. Die Methode eignet sich ausgezeichnet, das sog. IVF Pattern zu ergänzen und hat in die moderne andrologische Diagnostik Einzug gehalten.

Übersicht über die aktuellen Untersuchungsmethoden

Untersuchungen zum Zustand des Spermienchromatins und seinem Funktionsstatus sind damit routinemässig möglich geworden:

  1. Kondensation (Histon/Protamin-Ersatz)  Anilinblau-Test oder Chromomycin A3 oder Toluidin Blau Test
  2. Dekondensation (SDS Test)
  3. Semiquantitative Bestimmung der Doppelhelixveränderungen (Acridin-Orange-Test)
  4. Semiquantitative Bestimmung der DNA-Fragmentation und Apotpose  (TUNEL – Methode)

 

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Sperm Chromatin Structure Assays – wann sind sie anzuwenden ?

Die Einführung dieser Methoden in die Andrologischen Abklärungen hat die diagnostische und prognostische Aussagekraft massiv verbessert bzw. in einem biologisch entscheidenden Bereich erweitert. Die Kernstrukturanalysen sind bei folgenden Indikationen durchzuführen:

  • sog. Unexplained infertility (WHO)
  • isolierte sog. monomorphe Teratozoospermien
  • schwere idiopathische OAT Syndrome
  • als zwingend integrierender Bestandteil des andrologischen IVF Patterns

Der Entscheid, einen neuen Test in die klinische andrologische Praxis einzuführen ist weitestgehend abhängig von der Anzahl der bereits publizierten Arbeiten zum Zusammenhang zwischen dem Ausmass des DNA Schadens und der Fertilisierungsrate, Schwangerschaftsrate und Implantationsrate. Zahlreiche Arbeiten konnten enge Zusammenhänge zwischen dem Ausmass

belegen. Seit einigen Jahren bestehen intensive Bemühungen, diese Untersuchungen in die Routinediagnostik der Fertilitätsabklärungen zu integrieren. Berücksichtigt man die unterschiedlichen Typen der DNA Defekte und die unterschiedlichen Resultate der bisherigen Untersuchungen, so muss es einleuch- ten, dass nicht ein einzelner Test dieses Spektrum abdecken kann sondern mehrere Testverfahren in Klinikalltag einzusetzen sind. Das diagnostische Spektrum des sog. IVF-Patterns wird damit erheblich erweitert und das diagnostische Instrumentarium verfeinert.

Heute liegen die Auswertungen von Studien vor, die von einer ganzen Reihe von Kliniken bei unterschiedlichsten Fragestellungen vorgenommen wurden. Diese Re- sultate zusammenfassend lässt sich eine erhöhte DNA Fragmentation (DFI) ver- schiedenen pathologischen Zuständen zuordnen wie

Bei infertilen Männern konnten pathologische SCSA Tests bei sonst völlig normalen Spermienparametern nachgewiesen werden: der SCSA wird aus diesem Grunde als unabhängiger prognostischer Faktor für Schwangerschaftsraten sowohl bei der IVF, ICSI als auch bei der IUI angesehen. Er stellt einen äusserst sensitiven Marker für eine gestörte Spermatogenese dar – sog. posttestikuläre Ätiologien treten klar in den Hintergrund (erstaunlicherweise korreliert der SCSA auch nicht mit dem Alter der infertilen Männer)

Die Kernstrukturanalysen werden vom Institut für Dematohistopathologie und Andrologie Zürich gemäss den geltenden Richtlinien der andrologischen Fachgesellschaften und Literatur durchgeführt (*). Die Resultate werden in den Laborberichterstattungen separat ausgewiesen und bezüglich klinischer Relevanz kommentiert. Bei Fragen stehen wir selbstverständlich jederzeit uneingeschränkt zur Verfügung.

(*) empfohlene Literatur:  Sperm DNA Fragmentation: a Controversy. Fertil Steril 84;833 (2005)

Ausführliche Literaturangaben und –zusammenstellungen auf Wunsch erhältlich

 

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